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產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌（STEC）的威脅：STEC是導(dǎo)致嚴(yán)重食源性感染的主要病原體之一，其常見的血清型包括大腸桿菌O157、O26、O45、O103、O111、O121和O145。這些菌株可引發(fā)一系列嚴(yán)重癥狀，如腹瀉、出血性結(jié)腸炎，甚至溶血性尿毒癥綜合征（HUS），后者可能導(dǎo)致腎功能衰竭和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，對公共健康構(gòu)成重大威脅。
疫苗現(xiàn)狀的挑戰(zhàn)：目前，尚無許可的疫苗能夠提供針對多種STEC感染的有效保護(hù)。已開發(fā)的疫苗，如Epitopix SRP和Econiche，主要針對牛O157大腸桿菌感染，且缺乏對非O157血清型的交叉保護(hù)，這限制了其在更廣泛范圍內(nèi)的應(yīng)用。
外膜囊泡（OMV）的潛力：OMV是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜釋放的球形納米級結(jié)構(gòu)，含有多種免疫原性抗原，如脂多糖（LPS）、脂蛋白和肽聚糖。由于其天然的免疫原性和良好的生物相容性，OMV被視為下一代疫苗的理想載體。
本研究旨在構(gòu)建工程改造的鼠傷寒沙門氏菌，快速產(chǎn)生低內(nèi)毒素活性的外膜囊泡（OMV），用于遞送大腸桿菌的 O 抗原。同時評估展示混合 O 抗原的 OMV 的免疫原性，以及其對抗多種野生型 STEC 感染小鼠的能力，為開發(fā)新型、廣譜的 STEC 疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
研究人員使用等位基因交換方法，依次在SW121（ΔrfbPΔfliCΔfljB）基因組中引入ΔpagP81、ΔpagP81::PlpplpxE、ΔtolR和Δasd突變，生成工程化鼠傷寒沙門氏菌菌株。同時，構(gòu)建了攜帶大腸桿菌O111、O157、O26、O45、O145和O103 O抗原生物合成基因的質(zhì)粒，并導(dǎo)入到工程化鼠傷寒沙門氏菌中，以實(shí)現(xiàn)O抗原的表達(dá)。
圖1. 鼠傷寒沙門氏菌衍生的OMV顯示混合異源O抗原示意圖
OMV的生產(chǎn)和純化
工程化沙門氏菌在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過超速離心和密度梯度離心等方法分離和純化OMV，以獲得高純度的OMV樣品。
免疫接種：小鼠通過腹腔注射接受含1μg OMV的PBS溶液，作為陰性對照組則給予不含載體的沙門氏菌衍生的OMV。
免疫原性評估：在初次免疫后第14天、第35天、第49天和/或第120天采集血樣，通過ELISA測定血清中大腸桿菌LPS特異性IgG和IgA抗體的濃度，以評估OMV的免疫原性。
生存試驗(yàn)：在初次免疫后第8周，通過腹腔注射挑戰(zhàn)評估免疫小鼠的保護(hù)率，以驗(yàn)證OMV疫苗的保護(hù)效果。
糞便細(xì)菌負(fù)荷：研究口服途徑感染大腸桿菌后，免疫小鼠糞便中野生型大腸桿菌O111和O157的水平，以進(jìn)一步評估疫苗的保護(hù)作用。
流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用
補(bǔ)體沉積試驗(yàn)：初次接種后第 49 天采集同一組雌性小鼠血清樣本，混合并在 56°C 下滅活 30 分鐘。將野生型大腸桿菌 O111 或 O157 菌株與熱滅活混合血清混合，孵育后用 PBS 洗滌，再暴露于含有幼兔補(bǔ)體的 PBS 溶液中孵育。處理過的細(xì)菌用 FITC 偶聯(lián)的山羊抗兔補(bǔ)體多克隆抗體處理，最后使用流式細(xì)胞儀檢測分析 C3 補(bǔ)體沉積情況，評估抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體激活能力。
工程化OMV疫苗能產(chǎn)生功能性血清抗體：通過層浪流式細(xì)胞儀（FongCyte?)檢測FITC熒光信號，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組接種工程化OMV疫苗的小鼠混合血清在相應(yīng)的E. coli菌株上介導(dǎo)了相似水平的C3沉積（ 圖2A和B），這表明免疫小鼠產(chǎn)生的抗體能夠有效地識別并結(jié)合到細(xì)菌表面，進(jìn)而激活補(bǔ)體系統(tǒng)。
載體安全性驗(yàn)證：相反，OMV載體組未檢測到細(xì)菌上的C3沉積（圖2A和B）。這說明OMV載體本身不會引發(fā)非特異性的補(bǔ)體激活，從而驗(yàn)證了疫苗載體的安全性。
圖2 血清抗體體外生物功能檢測
層浪流式細(xì)胞儀FongCyte?
意義
這些結(jié)果表明，工程化鼠傷寒沙門氏菌 OMV 誘導(dǎo)的針對大腸桿菌 O111 和 / 或 O157 O 抗原的特異性血清抗體具有顯著生物學(xué)功能。它們不僅能特異性結(jié)合到細(xì)菌表面，還能有效介導(dǎo)補(bǔ)體沉積，這是宿主免疫系統(tǒng)抵御病原體和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要過程。此外，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果支持了 OMV 作為疫苗載體的潛力。由于 OMV 能誘導(dǎo)產(chǎn)生具有補(bǔ)體沉積能力的功能性抗體，有望成為開發(fā)新型、廣譜疫苗的有效工具。
疫苗開發(fā)的新策略：本研究開發(fā)的STmOMV能夠展示混合異源O抗原，為預(yù)防多種STEC感染提供了一種創(chuàng)新且改進(jìn)的策略。與傳統(tǒng)的單一抗原疫苗相比，這種混合O抗原的OMV疫苗具有更廣譜的保護(hù)作用。
免疫原性評估的新方法：傳統(tǒng)的疫苗評估方法多聚焦于抗體水平的檢測，而本研究則通過流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)手段，進(jìn)一步評估了抗體的功能活性，為疫苗研發(fā)提供了更全面的評估指標(biāo)。
多價疫苗的潛力：研究顯示，三種混合的 STmOMV 經(jīng)腹腔注射小鼠后，可對六種大腸桿菌感染產(chǎn)生有效保護(hù)，表明 OMV 中混合多糖或?yàn)槎鄡r疫苗，能覆蓋常見大腸桿菌血清型，該開發(fā)策略既擴(kuò)大疫苗保護(hù)范圍，又有助于減少接種次數(shù)與成本，具重要公共衛(wèi)生意義。
安全性與免疫原性的平衡：OMV 作為疫苗載體實(shí)現(xiàn)二者有效平衡，本研究表明其本身不引發(fā)非特異性免疫反應(yīng)或毒性作用，保障安全性，同時能有效遞送抗原并誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，確保免疫原性，為未來疫苗開發(fā)提供新思路
參考文獻(xiàn)：
Bian, X., Chen, Y., Zhang, W. et al. Salmonella Typhimurium derived OMV nanoparticle displaying mixed heterologous O-antigens confers immunogenicity and protection against STEC infections in mice. Microb Cell Fact 24, 8 (2025). https://doi.org/10.1186/s12934-024-02640-6
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