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Ⅰ：跟著步驟走，小鼠脾臟組織單細(xì)胞懸液制備so easy！
Ⅱ：一學(xué)就會(huì)！小鼠淋巴結(jié)&胸腺單細(xì)胞懸液制備全流程
口腔黏膜是機(jī)體重要屏障，由層狀上皮覆蓋，抵御病原體入侵、保護(hù)內(nèi)部組織。按解剖和結(jié)構(gòu)可分為內(nèi)襯、咀嚼和特化黏膜，其中頰部屬內(nèi)襯黏膜。黏膜中復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)既調(diào)控抗原反應(yīng)，又維持耐受，一旦失衡可引發(fā)牙周炎。
在本期推文中，我們將為您詳述小鼠口腔組織單細(xì)胞懸液的制備及流式分析流程。
37 °C快速解凍→56 °C水浴滅活60 min→分裝→ –20 °C冷凍保存
500 mL PBS（磷酸鹽緩沖液） + 2% （v/v）FCS，充分混勻
每個(gè)樣品各1mL消化混合物
FACS緩沖液中：膠原酶 Ⅱ （終濃度為2 mg/mL） + DNase I （終濃度為1 mg/mL）
每個(gè)樣品各1mL Dispase Ⅱ溶液
FACS緩沖液中：Dispase Ⅱ（終濃度達(dá)到2 mg/mL）
圖1
圖2
1.下頜骨分離：
處死小鼠后，自下門牙之間用組織剪刀切開，取下頜骨兩側(cè)（圖2A）并用針固定（圖1）。
2.處理舌頭和頰粘膜：
· 切斷舌頭（圖1藍(lán)色處），并去除肌肉，放置在1mL預(yù)冷FACS緩沖液的24控板中；
· 細(xì)剪刀剪取頰黏膜兩側(cè)（圖1紅色處），同樣置于含有1mL預(yù)冷FACS緩沖液的24孔板中。
3.其他口腔組織取樣：
· 去除上門牙后面軟硬組織（圖2B）第三磨牙后軟硬組織做切口（圖2C）；
· 拉下下頜骨，進(jìn)入鼻腔，與上腭平行切割組織（圖2D）；
· 另一側(cè)重復(fù)該操作，切下腭骨、上頜骨與中間的腭部（圖2E），分離牙齦組織（圖2F）。
4.分離上腭組織與NALT：
精確去除牙齦上腭組織和NALT（鼻相關(guān)淋巴組織）后，放置在1 mL FACS緩沖液的冰上24孔板中
1. 將組織置1.5 mL EP管，加入200 μL消化混合物；
2. 細(xì)剪至微碎，每次操作后清潔剪刀防止交叉污染；
3. 每個(gè)樣品再加入800 μL消化混合物，37 °C恒溫振蕩（1200 rpm）20 min；
4. 繼續(xù)加20 μL 0.5 M EDTA（終濃度為10 mM），37 °C恒溫?fù)u床上再孵育10 min；
5. 上下移液樣品數(shù)次，使其70 μm濾器進(jìn)入50 mL管收集細(xì)胞，先用1 mL緩沖液清洗1.5 mL EP管，渦旋后倒入細(xì)胞過濾器，使用10 mL緩沖液沖濾過濾器；
6. 過濾后的樣品在4 °C以下、350 × g條件下離心5 min，棄上清，在500 μL緩沖液中重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后冰上保存 。
在處理上頜骨牙齦組織時(shí)，要小心精確地清除NALT，因其富含白細(xì)胞，若殘留易造成樣本污染。
在消化混合物中直接切割組織，可有效避免切割后轉(zhuǎn)移細(xì)胞過程中的細(xì)胞丟失。
組織消化后，可在FACS緩沖液中添加2 mM的EDTA，以防止細(xì)胞聚集，避免堵塞FACS儀器。
如需分開分析上皮細(xì)胞和固有層，可在膠原酶/DNAse消化前進(jìn)行分離。分離后，將組織分別在37°C的Dispase II溶液中孵育，牙齦組織孵育35分鐘，頰黏膜孵育60分鐘，舌組織孵育70分鐘。
通過特定的圈門策略對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類分析，圈門過程基于細(xì)胞的多種特性和標(biāo)記物表達(dá)情況分析口腔黏膜組織中的樹突狀細(xì)胞（DC）和朗格漢斯細(xì)胞（LC）亞群。
(A) 從左至右依次為
1. 排除碎片：FSC-A/SSC-A；
2. 圈出單個(gè)細(xì)胞：FSC-A/FSC-H；
3. 排除死亡細(xì)胞：活性染料陰性群體；
(B) 界定中性粒細(xì)胞：CD45+Ly6G+；
(C) 細(xì)分MHC-II+細(xì)胞：
1.抗原呈遞細(xì)胞（APC）：MHC-II+CD11c-；
2.樹突狀細(xì)胞（DC）：MHC-II+CD11c+；
(C) 識(shí)別巨噬細(xì)胞：MHC-II+CD11b+ （可加CD11b和F4/80進(jìn)一步確認(rèn)）；
(D) 區(qū)分LC和間質(zhì)DC：
1.朗格漢斯細(xì)胞（LC）：EpCam+Langerin+；
2.間質(zhì)DC：EpCam?Langerin-；
(E) 細(xì)分LC亞群：
1.CD11b+ LC：CD11b+CD64-；
2.moLC：CD64+CD11b+；
(F) 3.CD103+ LC：CD11b-CD64-；
4.CD103+ LC：CD103呈陽(yáng)性表白；
(F) 區(qū)分間質(zhì)DC亞群：
1.cDC1：Sirpα-XCR1+，CD11-；
2.cDC2：Sirpα+XCR1neg，多數(shù)表達(dá)CD11b。
抗體濃度需根據(jù)流式細(xì)胞儀及其激光進(jìn)行調(diào)整。
不同口腔黏膜組織中樹突狀細(xì)胞（DC）亞群的分布存在差異，這是因?yàn)槊糠N組織都有其獨(dú)特的白細(xì)胞組成。為避免細(xì)胞結(jié)合的Fcγ受體對(duì)染色抗體的非特異性識(shí)別，可使用市售的純化大鼠抗小鼠抗CD16/32抗體，以阻斷Fcγ RIIB/III受體。
與皮膚不同，在口腔組織中，CD24與Langerin不存在相關(guān)性，因此不能用CD24替代Langerin來避免細(xì)胞內(nèi)染色。
若要分析朗格漢斯細(xì)胞（LC）等稀有細(xì)胞類型的亞群，建議每個(gè)樣本匯集3-5只小鼠的口腔組織，以確保流式細(xì)胞術(shù)（FACS）分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
為避免在樣本采集過程中細(xì)胞丟失，在采集前可增加用于重懸細(xì)胞的FACS緩沖液的體積。
首次進(jìn)行抗體染色混合時(shí)，建議使用專用的Brilliant Stain Buffer，以消除基于聚合物的熒光染料之間的非特異性反應(yīng)，因?yàn)檫@種反應(yīng)可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)補(bǔ)償不足。
參考文獻(xiàn)
Probst, Hans 等. (2022). Guidelines for DC preparation and flow cytometry analysis of mouse nonlymphoid tissues. European Journal of Immunology. 53. n/a-n/a. 10.1002/eji.202249819.
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