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肺部是機(jī)體與外界環(huán)境接觸最為頻繁的器官之一，每一次呼吸都可能遭遇病原體、過敏原和污染物等潛在威脅。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，肺部建立了一個(gè)高密度的抗原呈遞細(xì)胞（APC）網(wǎng)絡(luò)，其中包含專業(yè)的樹突狀細(xì)胞（DC）和特定的巨噬細(xì)胞子集。這些細(xì)胞宛如忠誠的哨兵，不僅承擔(dān)警戒職責(zé)，更能夠?qū)η秩氲牟≡w及其他免疫威脅發(fā)起有效的免疫應(yīng)答。由此可見，肺部在機(jī)體免疫系統(tǒng)中具有舉足輕重的地位，是深入探索免疫功能與機(jī)制的重要窗口。
在本篇推文中，我們將介紹一套制備小鼠肺組織單細(xì)胞懸液的詳細(xì)方法，并通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)肺部的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進(jìn)行檢測和分析。
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使用無菌溶液和無菌操作，將脫氧核糖核酸酶I（DNAse I）溶解在PBS中，使終濃度為500 U/mL。
膠原酶IV（Collagenase IV）：
使用無菌溶液和無菌操作，將膠原酶IV溶解在PBS中，使其濃度達(dá)到10,000 U/mL。
在水浴中以37°C解凍FCS，一旦完全解凍，在56°C的水浴中孵育30 min。通過無菌0.45μm過濾器直接過濾溫?zé)岬腇CS，并制備等分試樣。將熱滅活FCS儲(chǔ)存在-20°C下，避免重復(fù)凍融循環(huán)。在整個(gè)過程中使用無菌操作。
流式緩沖液（FACS Buffer）：
在500 mL PBS中加入2%的FCS（v/v）和22 mM EDTA。
消化液：
每只小鼠，在RPMI培養(yǎng)基中制備2 mL由200 U/mL膠原酶IV和0.5 U/mL DNAse I組成的消化液。
將186.2gEDTA（乙二胺四乙酸二水二鈉鹽）溶解在800 mL水中，加入20 g氫氧化鈉微球。將pH調(diào)整到8，并將水添加到1000 mL。在室溫下保存，使用前記得將緩沖液稀釋至1倍濃度。
小鼠肺組織單細(xì)胞懸液的逐步制備
1.處死小鼠，用爪子把動(dòng)物固定在墊子上。向動(dòng)物噴灑70%的乙醇；
2.切開腹部以上的皮膚，進(jìn)一步向下巴開放，暴露腹腔；
3.用一把鈍尖剪刀切開肋骨，打開腹腔；把肋骨拔掉；
4.對(duì)肺進(jìn)行解剖。右肺由四個(gè)葉組成，而左肺只有一個(gè)葉；
5.小心地切斷氣管，去除任何附著在肺上的脂肪；
6.將肺取入含有300 μl消化溶液的2 mL離心管中；
7.用剪刀把肺壓在管子里切成小塊；
8.加入700 μl的消化液；
9.樣品在800 rpm下，37℃孵育30 min；
10.從搖床上取出試管，再加1 mL消化液；快速渦旋樣品；
11.將樣品以800 rpm在37°C下孵育30 min；
12.從搖床上取出管子，放在冰上敷2 min；
13.加入40 μl 500 mM EDTA，冰下孵育2 min；
14.用1 mL FACS緩沖液在50 mL管上制備70 μm細(xì)胞過濾器；
15.將肺細(xì)胞懸液倒入細(xì)胞過濾器上；
16.加入9 mL的FACS緩沖液，從過濾器中清洗剩余的細(xì)胞；
17.380×g離心7 min；
18.將細(xì)胞重懸1×ACK裂解緩沖液中，室溫孵育2 min；
19.加入過量的FACS緩沖液，停止裂解；
20.380×g離心7 min;
21.在2 mL FACS緩沖液中重懸浮細(xì)胞。用70 μm的細(xì)胞過濾器細(xì)胞懸液，去除團(tuán)塊；
22.計(jì)數(shù)，準(zhǔn)備制備染色樣本
通過酶消化8周齡C57BL/6小鼠肺制備單細(xì)胞懸浮液，然后用一組15種表面標(biāo)記物染色。記錄3×106個(gè)事件，用于隨后鑒定肺髓系來源細(xì)胞。排除碎片和粘連體后，通過CD45的表達(dá)來鑒定免疫細(xì)胞。排除譜系陽性淋巴細(xì)胞（B220+、CD19+、Nk-1.1+、NKP46+、Ter-119+、TCR-β+）和死細(xì)胞（APC-Cy7中的DRAQ7+）。根據(jù)其表面標(biāo)記物表達(dá)模式，鑒定了小鼠肺中存在的所有髓系來源細(xì)胞。
圖1流式圈門
圖2流式分析的畫門策略
圈門邏輯：
A.細(xì)胞根據(jù)其大?。‵SC-A/SSC-A）進(jìn)行圈門，以排除碎片；
B.通過FSC-A/FSC-W和SSC-A/SSC-W排除粘連體，圈出單個(gè)細(xì)胞；
C.圈出CD45+總免疫細(xì)胞；
D.在CD45+門中，圈出Lin+DRAQ7-細(xì)胞群；
E.在Lin+DRAQ7-細(xì)胞群中，通過Ly6G+圈出中性粒細(xì)胞；
F.Ly6G-群體中，界定CD64+MerTK+的巨噬細(xì)胞，并在巨噬細(xì)胞中通過CD11b和SigleF鑒定肺泡巨噬細(xì)胞和間質(zhì)巨噬細(xì)胞；
G.在CD64-MerTK-群中，通過CD11c和MHC-II圈門：
1.CD11c-MHC-II-門中，進(jìn)一步圈出CD11b+細(xì)胞群，在CD11b+圈中，SigleF+群體為嗜酸性粒細(xì)胞；
2.SigleF-群體中，再通過CD43-Ly6c+鑒定Ly6c高表達(dá)單核細(xì)胞，CD43+Ly6c-鑒定Ly6c低表達(dá)單核細(xì)胞；
3.CD11c+MHC-II+門中,圈出CD64-CD26+細(xì)胞群；
4.在此門下，通過CD172α+XCR1+鑒定cDC1；CD172α+XCR1-鑒定cDC2
5.cDC2可進(jìn)一步用過CD11b和CD301b區(qū)分為：CD301b+cDC2和CD301b-cDC2
參考文獻(xiàn)：Probst, Hans Christian et al. “Guidelines for DC preparation and flow cytometry analysis of mouse nonlymphoid tissues.” European journal of immunology, 10.1002/eji.202249819. 13 Dec. 2022, doi:10.1002/eji.202249819
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