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胸腺作為T細(xì)胞的"搖籃"，其發(fā)育機(jī)制直接影響免疫系統(tǒng)的建立。本期應(yīng)用精要將通過(guò)14色流式方案精準(zhǔn)解析人類胸腺細(xì)胞分化軌跡，為免疫缺陷、自身免疫病研究提供全新視角。
胸腺通過(guò)獨(dú)特的微環(huán)境調(diào)控T細(xì)胞從造血干細(xì)胞到功能細(xì)胞的蛻變過(guò)程。盡管小鼠模型研究已較為成熟，但人類早期胸腺發(fā)育仍存在諸多空白。近年來(lái)，單細(xì)胞RNA測(cè)序和CD分子表達(dá)的研究揭示了胸腺細(xì)胞的分子異質(zhì)性，而建立標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞分群體系成為關(guān)鍵突破點(diǎn)。
本研究通過(guò)單管14色方案精準(zhǔn)的抗體選擇和門控策略來(lái)了解人類胸腺細(xì)胞分類，揭示了T細(xì)胞從早期胸腺祖細(xì)胞（ETP）到成熟T細(xì)胞的完整發(fā)育軌跡（圖1）。
（圖1. T細(xì)胞在人類胸腺中的發(fā)育軌跡）
試劑方案
分析邏輯
■基于磷脂酰絲氨酸暴露原理，采用Annexin V聯(lián)合膜完整性染料可同步鑒別活細(xì)胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡（Annexin V+/PI-）和晚期凋亡/壞死細(xì)胞（Annexin V+/PI+）。
祖細(xì)胞遷移與定向階段：
■CD34+造血干細(xì)胞獲得CD45RA+表達(dá)進(jìn)入胸腺，發(fā)育成早期胸腺祖細(xì)胞（ETP：CD34+CD45RA+CD1a-CD45-）；
■Notch信號(hào)激活驅(qū)動(dòng)T系定向分化，CD1a表達(dá)標(biāo)志著T系定向祖細(xì)胞（TC）形成，同時(shí)抑制向B/NK/DC等分化潛能；
■CD7作為早期T系特征分子持續(xù)表達(dá)，在TC階段啟動(dòng)TCRγδ基因座優(yōu)先重排。
TCR重組與雙陽(yáng)性發(fā)育：
■CD7+亞群內(nèi)啟動(dòng)TCRβ鏈重排，伴隨CD4單陽(yáng)性細(xì)胞（ISP4）形成（CD4+CD34±）；
■功能性TCRβ與前Tα鏈配對(duì)驅(qū)動(dòng)雙陽(yáng)性轉(zhuǎn)化，形成CD4+CD8+CD3-早期雙陽(yáng)性細(xì)胞（EDP：CD7+CD34midCD45lowCD3-）；
■TCRα鏈重排完成時(shí)EDP轉(zhuǎn)化為晚期雙陽(yáng)性細(xì)胞（LDP：CD4+CD8+CD3+）。
譜系選擇機(jī)制：
■陽(yáng)性選擇：TCR與胸腺基質(zhì)MHC分子適度互作決定存活，MHC-I親和力主導(dǎo)分化為CD8+SP，MHC-II導(dǎo)向CD4+SP；
■陰性選擇：通過(guò)AIRE介導(dǎo)的自身抗原呈遞清除高親和力克??；
■發(fā)育選擇窗口：高強(qiáng)度TCR信號(hào)在DP階段即可誘導(dǎo)Treg分化（CD25+Foxp3+）。
成熟與外遷調(diào)控：
■經(jīng)歷選擇的單陽(yáng)性細(xì)胞（SP4/SP8/Treg）下調(diào)CD69并上調(diào)CD45RA；
■成熟T細(xì)胞外遷標(biāo)志：CD3+CD45RA+CD69-表型特征。
結(jié)果呈現(xiàn)
■門控策略明確區(qū)分ETP（CD34+CD45RA+）、TC（CD1a+）、EDP/LDP（CD4+CD8+CD3±）、ISP4（CD4+CD34+）及成熟亞群（SP4/SP8/Treg/Tγδ）；
■比例分析（Fig1C）顯示DPs占胸腺細(xì)胞75%以上，其中早期雙陽(yáng)性（EDP）數(shù)量是晚期雙陽(yáng)性（LDP）的2倍；
■未成熟群體（CD45low）以ISP4 CD34+為主，成熟群體（CD45high）以SP4（>50%）為主導(dǎo)，依次為SP8、Treg和Tγδ細(xì)胞。
Figure 1A
分子動(dòng)態(tài)的可視化解析（Fig1D-E）：
■UMAP算法揭示CD45+群體連續(xù)分化軌跡：從CD34highCD7low的ETP起始，經(jīng)CD7+CD1a+的TC階段，向CD4/CD8雙陽(yáng)性區(qū)室演進(jìn)；
■關(guān)鍵分子共表達(dá)模式：CD34與CD45呈現(xiàn)梯度互斥，CD3表達(dá)嚴(yán)格限定于LDP及后續(xù)成熟階段，TCR信號(hào)相關(guān)標(biāo)記（CD28/CD69）沿發(fā)育軸線動(dòng)態(tài)變化。
Figure 1D-E
發(fā)育結(jié)算驗(yàn)證與定量關(guān)系：
■EDP向LDP轉(zhuǎn)化效率（2:1比例）佐證TCRα鏈重排的生物學(xué)瓶頸；
■SP4優(yōu)勢(shì)占比（Fig1C）與MHC-II限制性選擇的進(jìn)化保守性相符；
■Treg（~5%）和Tγδ（~3%）的穩(wěn)定比例反映胸腺微環(huán)境對(duì)特殊亞群的精準(zhǔn)調(diào)控。
Figure 1C
知識(shí)拓展
表型指標(biāo)：CD34+, CD45-, CD45RA+, CD1a-,CD7+, CD117 (c-Kit)+
特征：早期T細(xì)胞前體，具有多能性，尚未完全定向到T細(xì)胞譜系。
表型指標(biāo)：CD34+, CD45- ,CD1a+,CD4-,CD8-
特征：已定向到T細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
表型指標(biāo)：CD34+, CD45- ,CD1a+,CD4+,CD8-
特征：未成熟的單陽(yáng)性CD4細(xì)胞，仍表達(dá)CD34。
表型指標(biāo): CD34-,CD45+, TCRγδ-, CD4+,CD3-,CD8 -
特征：未成熟的單陽(yáng)性CD4細(xì)胞，不表達(dá)CD34。
表型指標(biāo)：CD34+,CD45low, CD1a+ , CD4+, CD8+,
特征：早期雙陽(yáng)性細(xì)胞，CD45表達(dá)較低。
表型指標(biāo)：CD34 -, CD45hight, CD4+, CD8+,CD7-
特征：早期雙陽(yáng)性細(xì)胞，CD45表達(dá)較高。
表型指標(biāo)：CD45+, CD4+, CD8+,CD3 + CD7+
特征：晚期雙陽(yáng)性細(xì)胞，接近單陽(yáng)性階段。
表型指標(biāo)：CD4+, CD3+, CD8-, CD69+, CD45RA-/low
特征：成熟的單陽(yáng)性CD4細(xì)胞。
表型指標(biāo)：CD8, CD3+, CD4-, CD69 (部分表達(dá)), CD45RA -/low
特征：成熟的單陽(yáng)性CD8細(xì)胞。
表型指標(biāo)：CD4+, CD3+, CD8-,CD69-, CD45RA height, CD1a-
特征：準(zhǔn)備離開胸腺的單陽(yáng)性CD4細(xì)胞。
表型指標(biāo)：CD8+, CD3 +,CD4-, CD69-, CD45RA height, CD1a-
特征：準(zhǔn)備離開胸腺的單陽(yáng)性CD8細(xì)胞。
表型指標(biāo)：CD34-,CD45+,TCRγδ+, CD3+/hight， CD4-/low , CD8 -/low
特征：γδT細(xì)胞，具有獨(dú)特的TCRγδ受體。
表型指標(biāo)：CD4+, CD25 hight, FoxP3+, CD3+, CD45+，CD45RA-
特征：調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，具有免疫抑制功能。
表型指標(biāo)：CD4+, CD25 +, FoxP3+, CD3+, CD69-, CD45RA+/hight
特征：準(zhǔn)備離開胸腺的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
結(jié)語(yǔ)：
本研究建立的14色方案為胸腺發(fā)育研究提供了標(biāo)準(zhǔn)化工具，其揭示的細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化機(jī)制為免疫疾病診療帶來(lái)新思路。
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參考文獻(xiàn)：Front Immunol. 2023;14:1123245. DOI:10.3389/fimmu.2023.1123245
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